【产品名称】

【货号】YRMBV7115

【包装规格】50 Tests/kit

【检测原理】

本试剂盒采用TaqMan探针实时荧光RT-PCR技术，针对非洲猪瘟病毒（ASFV）基因组保守序列区域设计特异引物和探针，可定性检测猪扁桃体、淋巴结等组织和血液、血清中ASFV 病毒DNA，适用于ASFV病毒的检测、辅助诊断及流行病学调查。

【试剂盒产品组成】

【储存条件及有效期】

避光-20℃贮存，并避免反复冻融。有效期均为12个月。（请于有效期内使用）

【适用仪器】

YR8000、ABI PRISM^®7900、ABI PRISM^®7500、ABI PRISM^®7300、ABI PRISM^®7700、ABI PRISM^®7000、MJ Opticon2、BIORAD iCycler、Roche LightCycler^TM、Qiagen Rotor Gene 等。

【样本制备】

可采集发病动物或同群动物的血清学样品和病原学样品，病原学样品主要包括抗凝血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏和骨髓等。如环境中存在钝缘软蜱，也应一并采集。

样品的包装和运输应符合农业部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》规定。规范填写采样登记表，采集的样品应在冷藏和密封状态下运输到相关实验室。

一、血清学样品：无菌采集5ml血液样品，室温放置12～24h，收集血清，冷藏运输。到达检测实验室后，冷冻保存。

二、病原学样品

1.抗凝血样品

无菌采集5ml抗凝血，冷藏运输。到达检测实验室后，－70℃冷冻保存。

2.组织样品

2.1**脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等，冷藏运输。

2.2样品到达检测实验室后，－70℃保存。

3.钝缘软蜱

3.1将收集的钝缘软蜱放入有螺旋盖的样品瓶/管中，放入少量土壤，盖内衬以纱布，常温保存运输。

3.2到达检测实验室后，－70℃冷冻保存或置于液氮中；如仅对样品进行形态学观察时，可以放入100%酒精中保存。

【操作步骤】

1. DNA提取：用户可采用配套提取试剂盒或其他通用型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取病毒DNA用于检测或保存于-20℃（-80℃更佳）以待检测。
2. 扩增试剂准备（在试剂贮存和准备区完成）
3. 加样（在样品制备区完成）
4. PCR扩增（在核酸扩增区完成）
5. 结果分析。分析条件设置：根据分析后图像调节基线（Baseline）的Start值、Stop值以及阈值（Threshold）的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、End值可以在5-20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），使仪器给出正确的结果。
6. 质量控制。阴性对照：FAM通道无扩增曲线，Ct值显示无数值或Ct值=40；阳性对照：FAM通道有扩增曲线，Ct值均≤30；以上两个要求在同一次实验中须同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。

7.检验结果的解释

7.1 当被检样品Ct值≤32并出现标准的“S”型扩增曲线，可判为ASFV阳性；

7.2 当被检样品32＜Ct值＜37并出现“S”型扩增曲线判为可疑，需重新取样提取DNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为ASFV阳性；

7.3 当被检样品Ct值≥37或无数值时，判定为ASFV阴性。对于某些未呈现明显的“S”型扩增曲线，但本底较高的样品，应为阴性。

【检测方法的局限性】

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运输、保存以及核酸提取环节有关；
2. 样本处理时没有控制好交叉污染，可能会导致假阳性结果；
3. 病菌在流行过程中的基因突变可能会导致假阴性结果；
4. 由于不同的核酸提取原理不同，采用不同核酸提取试剂进行样本核酸提取时的效率存在一定差异，推荐客户采用本公司生产的核酸提取试剂盒，用户也可根据具体要求进行选择确认；

【注意事项】

1. 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员应接受过基因扩增及分子生物学的专业培训，具备相关的实验操作资格，实验室应具备合理的生物安全防护设施及防护程序，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产品分析区），所用的消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；
2. 为试剂和标本准备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；
3. 试剂使用前要完全解冻，2,000rpm离心数秒后使用；
4. 试剂分装过程应尽量避免产生气泡，并注意防止泄漏，以避免荧光物质污染仪器；
5. 标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒液的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；
6. 实验完毕后用1%次氯酸钠或75%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器；
7. 本试剂盒内阳性质控应视为具有传染性的物质，操作和处理均需符合卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关法规要求。